在运用ELISA方法测定抗体方【fāng】面，通常所【suǒ】用的方法称为间接法，也是目前常【cháng】用的【de】方法，其【qí】原理：间接法【fǎ】首先用【yòng】抗原【yuán】包被于固相【xiàng】载体，这些【xiē】包被的抗原【yuán】必须是可【kě】溶【róng】性的，或者至少是极微小的颗粒，经洗【xǐ】涤【dí】，加入含有被测抗体之标本【běn】，再经孵育洗涤后【hòu】，加入酶标记抗抗【kàng】体【tǐ】，(对【duì】人的标本来说【shuō】即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM)，再【zài】经孵育洗涤后，加底物显色，底物【wù】降解的量，即为【wéi】欲测抗体的量，其结果可用目测或用分【fèn】光光度【dù】计定【dìng】量测【cè】定。

操作步骤：

1. 将抗原【yuán】按5μg/ml稀释于碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，100μl /孔，4℃过【guò】夜【yè】。

2. 次日PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

3. 加2％BSA封闭室温1h，200μl /孔。

4. 阳性对照从10ug/ml，做【zuò】倍必稀释，待测血清从1：50做倍比【bǐ】稀【xī】释，预试验后确定稀释倍【bèi】数及阳【yáng】性对照的起始浓度及稀释【shì】数量(以【yǐ】可以做标【biāo】准曲【qǔ】线【xiàn】为参数)，室温1h。

5. PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

6. 加入1：3000(不【bú】同公司有不【bú】同的推荐【jiàn】稀释【shì】度)PBS-T稀释的【de】HRP标【biāo】记的山羊抗人IgG，100μl /孔【kǒng】，室温1h。

7. PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

8. 显色，100μl /孔【kǒng】，颜色变深后中止显色，2M硫酸【suān】在BIO-RAD酶标仪上读数，可用ABTS，OPD，TMB等。